Trabalho 53 – Mariana Fernandes Augusto – CLONAGEM DA LIPASE TERMOESTÁVEL PF2001 DE PYROCOCCUS FURIOSUS PARA EXPRESSÃO CONSTITUTIVA EM PICHIA PASTORIS

CLONAGEM DA LIPASE TERMOESTÁVEL PF2001 DE PYROCOCCUS FURIOSUS PARA EXPRESSÃO CONSTITUTIVA EM PICHIA PASTORIS

M.F. AUGUSTO1*, G.C. BREDA2, M.V.H. MOURA2 E R.V. ALMEIDA2

1Universidade Federal do Rio de Janeiro, Pólo de Xerém

2Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Química

E-mail: lammp541@gmail.com

Um grupo de enzimas que se destaca no cenário industrial com alto potencial biotecnológico são as lipases. Nosso grupo de trabalho realizou a expressão da lipase Pf2001 da arqueia extremófila  Pyrococcus furiosus em Pichia pastoris através de uma construção gênica induzida por metanol (pPICZαPf). No presente trabalho foi realizada a clonagem para expressão constitutiva (pGAPZα), que dispensa o uso de metanol, substância tóxica, como indutor na expressão. Cepas de Escherichia coli DH5α que continham a construção pPICZα com o gene pf2001 e de E. coli JM109 que continham a construção pGAPZαB foram submetidas a extração de DNA plasmidial, com posterior digestão dos plasmídeos pelas enzimas XbaI e XhoI. Em gel de eletroforese em agarose 1%, foram extraídas as bandas correspondentes ao gene pf2001 e ao vetor constitutivo pGAPZα, posteriormente purificadas e submetidas a reação de ligação. Células competentes de E. coli TOP10 foram transformadas com a construção proveniente da reação de ligação e crescidas em meio de cultivo sólido contendo o antibiótico seletivo Zeocina (50 µg/mL). A confirmação da clonagem foi realizada com sucesso por extração plasmidial das colônias obtidas com digestão e observação em gel de agarose. Células de P. pastoris X33 foram transformadas com a construção pGAPZαPf linearizada por AvrII. Após a transformação, as células de levedura foram crescidas em meio sólido e posteriormente em meio líquido, ambos contendo Zeocina (200 µg/mL), tendo sido selecionadas 22 colônias que foram estocadas em ultrafreezer a -80°C para futuros testes de expressão.

Suporte Financeiro: FAPERJ, CAPES E CNPq ; Área: Bioquímica.

Download: Resumo Mariana Augusto (formato pdf)

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